全球已批准5款双抗药物上市，目前有超20个不同的商业化技术平台；双特异性抗体是指拥有两种特异性抗原结合位点的抗体，能够实现协同作用，从而提高升疗效。由于其独特的生物学机制，与单克隆抗体联合用药相比，双抗在抗肿瘤的临床研究和临床治疗中呈现出1+1＞2的显著优势。双抗主要通过基因重组技术进行生产，有多种多样的分子设计类型，满足双抗分子识别两种不同抗原的能力。根据是否含有Fc片段可以将双抗分为：IgG-like和Non IgG-like两大类。今天笔者将重点介绍IgG-like类双抗的纯化工艺。

 

IgG-Like类的双特性抗体
 

这类抗体的分子含有Fc区，因此保留了ADCC和CDC效应，可以增强肿瘤的杀伤效果，同时使双抗分子具有半衰期长、稳定性好的优势。然而，为了尽可能多的获得我们需要的分子类型，在重组表达这类双抗分子时需要进行一些分子的理性设计。

对称型的双抗，比常规IgG更长，除了未正确组装形成的半抗体外，通常不存在错配的型体；而非对称型的双抗，包括重链之间错配引起的同源抗体 (homodimeric Fc species)，轻链与重链之间错配引起的异源抗体 (heterodimeric Fc species)，结构不完整的片段抗体，如半抗体 (half antibody)或 3/4 抗体，以及轻链聚集体 (light chain dimer)，重链聚集体(heavy chain dimer) 等等。
 

重组表达过程中可能产生的双抗副产物

 

截止目前，已有多个不同的商业化技术平台用于双抗的研发，来降低上述副产物的产生，分别给出了可用于有效降低重链同源错配 (HC homodimerization) 以及轻链与重链错配 (HC-LC misparing）的分子设计策路，如BITE、Triomab、BEAT、DVD-Ig、DuoBody、CrossMab、DuetMab等。其中，最经典的要属降低重链同源错配的 KiH，即Knob-into-hole技术，以及降低轻链重链错配的CrossMab技术。但所有分子设计策略都只能尽量降低某类副产物的产生，而不能消除全部的副产物。不仅如此，在双抗的重组表达过程，还会不可避免的产生不完整的片段抗体以及聚集体,这些杂质都给双抗分子的下游工艺开发提出了挑战。
 

纳微科技多款填料已广泛应用于各种类型双抗分子的纯化，并陆续推出针对双抗聚集体、双抗片段和错配体等杂质去除的解决方案。
 

常见双抗副产物及其去除方法
 

Homodimer是双抗分子重组表达过程中常见的副产物，且由于Homodimer与目标bsAb理化性质都很相似，在实际开发中，借助于分子设计策略，更好的实现分离，通过ProteinA亲和层析，pH梯度洗脱而达到有效的分离或阳离子交换层析，考虑添加剂，如PEG等。
 

半抗、双抗片段、错配体均含有Fc结构，是双抗分子的重链或者轻链过表达，部分未形成正确的bsAb结构而产生的杂质，这类副产物由于与目标bsAb理化性质差异较大，通过亲和层析、离子交换层析或者疏水层析优化实验条件均可以达到有效的去除效果。例如可以通过利用片段或错配体与ProteinA 亲和层析结合能力的差异，通过优化中间淋洗条件和pH等度洗脱；或利用双抗片段和双抗单体净电荷的差异，采用弱阳离子交换层析进行纯化；或根据双抗片段和双抗单体疏水性的不同，采用疏水作用层析进行纯化等。
 

常见双抗副产物及层析纯化策略

应用案例

01、UniMab 50HC亲和层析去除双抗聚集体 

纳微科技的亲和层析介质UniMab 50 HC能有效捕获目标bsAb, 并可以利用其与聚集体与目标bsAb的亲和力差异，通过pH线性洗脱方式提高分辨率，去除聚集体及其他一些杂质。经SEC纯度检测，UniMab 50HC洗脱单体纯度为89.5%，回收率97.1%。
 

  

02、NM90Agarose HAM复合离子交换层析去除双抗聚集体

NM90Agarose HAM是一种带有疏水性的阴离子交换介质，能够分辨bsAb单体和聚集体的电荷及疏水性差异，通过流穿模式收集单体，有效去除聚集体。
 

 

03、UniMab 50HC亲和层析降低双抗片段或错配体含量
 

半抗、某些双抗片段、错配体、聚集体均含有Fc结构，能够与Protein A 层析介质结合，无法在上样阶段流穿除去。利用片段或错配体与UniMab 50HC结合能力的差异，通过优化中间淋洗条件和pH等度洗脱，在pH 5.5除去半抗体及片段，在pH 5.0收集目标bsAb单体，其余高聚集体及片段滞留于柱子上直到被pH 4.5缓冲液洗脱，从而获得高纯度的bsAb单体。
 

 

04、UniGel-30CM阳离子交换层析去除双抗片段杂质

双抗片段含有Fc结构，很难在Protein A亲和层析时完全去除。利用双抗片段和双抗单体净电荷的差异，采用UniGel-30CM弱阳离子交换层析进行纯化，结合较弱的双抗片段杂质先行被洗脱从而得以有效去除。
 

 

05、UniHR Phenyl-30L 疏水作用层析去除双抗片段杂质

双抗片段含有Fc结构，很难在Protein A亲和层析时完全去除。利用双抗片段和双抗单体疏水性的不同，采用UniHR Phenyl-30L疏水作用层析进行纯化，大部分双抗片段杂质都得到有效去除,回收率＞70%。
 

  

订货信息

抗体纯化相关产品订货信息

   

 

关于纳微

 

 

苏州纳微科技股份有限公司是一家专门从事高精度、高性能和高质量微球材料研发和生产的国家高新技术企业，是全球能提供多品种多规格微球产品的公司之一。
 

公司致力于建设全球先进的纳米微球精准制备和应用平台，产品涵盖硅胶正相、反相、HILIC、手性填料，聚合物反相、离子交换、疏水层析、亲和层析（Protein A、金属螯合、苯-硼-酸）、固相萃取、凝胶渗透色谱及特殊功能填料；提供色谱柱、磁珠、标准颗粒、分析检测、分离纯化实验技能培训及分离纯化整体解决方案。

 

• 电话｜400-828-1622 

• 邮箱｜info@nanomicrotech.com