案例分析|质粒DNA纯化工艺浅析_公司新闻

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案例分析|质粒DNA纯化工艺浅析

人阅读发布时间：2023-10-07 15:45

近年来，基因治疗作为一种新兴的治疗方法，受到广泛的关注。从世界上第一个腺相关病毒（AAV）基因治疗药物 Glybera，到 GSK 的慢病毒（LV）基因治疗药物 Strimvelis，再到诺华的自体回输 Car-T 细胞治疗和 Spark 的 Luxturna，AAV 和 LV 总是霸占头条，一时瑜亮。

核酸作为活性药物被应用于该疗法，作为纠正遗传异常或在基因疫苗接种中诱导免疫反应的一种方式。在各种临床试验中，非病毒载体如质粒DNA（pDNA）被广泛研究和考虑，特别是超螺旋（sc）质粒，由于其更高的安全性、完整性和生物效率，引起了研发人员的重视。

pDNA的生产通常在重组大肠杆菌（E. coli）宿主中通过发酵进行，约占大肠杆菌提取物总成分的3%，其余主要的杂质包含宿主蛋白（~65%）、宿主RNA（~25%）、宿主DNA（~3%）[1]。考虑到含pDNA的裂解液中存在的所有杂质，药物监管机构规定了必须的质量标准（表1）。

因此，当务之急是将pDNA从细胞碎片和其他杂质如宿主RNA、宿主蛋白和宿主DNA中完全分离出来。这些杂质大多与pDNA有一些相似的物理化学特征，如电荷、分子量和水溶性等，这对分离过程有很大限制。

色谱层析技术在pDNA纯化中应用

目前通常采用色谱层析对pNDA进行纯化，最常用的pDNA捕获方法是阴离子交换层析（AEXC），但使用AEXC，pDNA可能会与宿主DNA、高分子量RNA和内毒素共同洗脱，这些分子对阴离子交换基质的亲和力相似。另外分子筛、疏水[2]、亲和层析[1,3]、以及CHT也常用于pDNA纯化。其各自的优劣势如下表。

层析纯化方法

目前已有大量的pDNA下游纯化工艺被报道，笔者在这里例举了一些经典的方法（如图1）。

图1. 纯化sc-pDNA的不同工艺

工艺一、分子筛+Plasmid亲和层析+离子交换层析

前面一篇推文《超螺旋质粒DNA纯化案例分析》向大家展示了经典质粒三步法纯化工艺的应用，质粒DNA和RNA的分子量相差比较大，可以首先利用分子筛（NW Rose 6FF）去除宿主RNA杂质。由于pNDA粒径比较大，从分子筛介质微球间隙直接流出先出峰，而宿主RNA经过介质微球内部孔隙后出峰；接着利用Plasmid亲和层析介质（NW Rose Plasmid）特异性结合sc pDNA，oc pDNA与固定相结合较弱，可以高效去除；最后再用阴离子交换层析（NanoQ-30L）去除内毒素及其它痕量杂质。

工艺二、离子交换+疏水相互作用层析

Step 1. 阴离子交换层析纯化（UniGel-30DEAE）

Step 2. 疏水相互作用层析纯化（UniHR Phenyl-30L）

结果

本实验中，采用弱阴离子交换层析介质UniGel-30DEAE捕获pDNA，同时去除宿主DNA，收率达80%；再利用疏水层析介质UniHR Phenyl-30L，可进一步将痕量杂质去除，最终质粒收率达73.5%，纯度95%。

工艺三、离子交换+Plasmid亲和层析

在方法二的基础上，将疏水层析介质更换为Plasmid亲和层析介质（NW Rose Plasmid / NW Rose Plus Plasmid），oc DNA及内毒素等杂质在上样时流穿或在淋洗后去除，再通过洗脱获得高纯度的sc pDNA。

工艺四、羟基磷灰石（CHT）

许多层析介质最初是为纯化蛋白质而设计的，孔径对于纯化pDNA来说相对较小，实际有效吸附面积非常有限。这种限制导致吸附速度和载量都比较低，从而影响了纯化效率。为了解决这个问题，不少工艺开始选择使用大孔径的复合填料，其中包括CHT填料。相比于传统的填料，CHT具有更大的孔径，因此可以提供更多的有效吸附面积，从而提高吸附效率和载量。此外，CHT可以通过一步法获得药品级纯度的pDNA，对于宿主DNA、RNA以及内毒素都有不错的去除效率，提高纯化效率，减少操作步骤和时间。

目前纳微科技近期即将推出NMCHT Type I及NMCHT Type II两款羟基磷灰石层析介质，载量和杂质去除能力上均可比肩某国际品牌。

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